Sciences de la vie et de la terre

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Fiches techniques de préparation pour le laboratoire

 

 

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En partie basées sur les pages labo du site SVT de Lyon

ProduitsUtilisationsProtocoles

Extrait d'acide cyanhydrique

Blocage de la respiration mitochondriale - ExAO

Découper des feuilles de Laurier-Cerise (Prunus Lauro-Cerasus) en morceaux dans un mortier

Broyer les feuilles dans un peu d'eau physiologique ou de tampon de respiration pour mitochondries

Filtrer l'extrait qui contient de l'acide cyanhydrique libéré par hydrolyse et le broyage

Agar-agar

Remplissage des boites de pétri pour immunodiffusion (ex. Ouchterlony)

Pour 100 ml de gélose (10 boites) Peser 0.8g d'agar-agar.

Mélanger dans 100 ml d'eau distillée portée à ébullition.

Attendre que la solution reprenne une température proche des 50° pour couler 10 ml de gélose dans chaque boites.

Solution d'Albumine

 

 

Analyse de la matière organique - digestion des protides - Électrophorèse des protéines

Diluer 1 blanc d'œuf dans 200 ml d'eau distillée.

Chauffer doucement en agitant constamment ; vers 70°C, la solution prend un aspect laiteux par coagulation de l'ovalbumine.

Arrêter aussitôt le chauffage et filtrer une fois.

Bleu de méthylène

Colorant des membranes cellulaires et du noyau

Dissoudre 1 g de bleu de méthylène dans 1 litre d'eau distillée et bien mélanger

Bleu de méthylène phéniqué

Colorant des bactéries

Dissoudre 2 g de bleu de méthylène et 20 g de phénol dans 100 ml d'alcool à 95%

Carmin acétique

Colore à chaud les chromosomes des cellules de racines de liliacées et à froid les chromosomes des cellules des parois de glandes salivaires de chironomes

Dissoudre 0.5 g de carmin 40 pour histologie dans un mélange de 55ml d'eau distillée et 45ml d'acide acétique.

Porter le tout à ébullition et laisser bouillir 1 à 2 minutes. Laisser refroidir puis filtrer.

Se conserve bien à température ambiante.

Carmin alumé

Colorant de la cellulose

Dissoudre 1 g de carmin 40 pour histologie et 4 g d'alun de potassium dans 100ml d'eau distillée.

Faire bouillir très doucement pendant 1/4 d'heure, laisser refroidir et filtrer.

Attention la solution peut être contaminée par des moisissures.

Carmin vert d'iode (ou carmino vert de Mirande)

double coloration des tissus végétaux ; rose = tissus cellulosiques ; vert = tissus lignifiés

Dissoudre 6 g de carmin 40 pour histologie et 12 g d'alun de potassium dans 200 ml d'eau distillée. Chauffer à feu doux, ajouter 200ml d'eau distillée et 0.4 g de vert d'iode. Porter à ébullition puis laisser refroidir et filtrer.

Solvant pour chromatographie des glucides

Chromatographie des sucres sur gel de silice

60 % de méthyl-éthyl-cétone,

20 % d'acide acétique glacial,

20 % de méthanol.

Révélateur pour chromatographie des glucides

Révélateur des sucres lors d'une chromatographie

1 volume de permanganate de potassium à 2 %,

1 volume de carbonate anhydre de sodium à 4%.

Mélanger les deux parties au dernier moment en n'utilisant que les quantités nécessaires

Solvant pour chromatographie de l'acide lactique

Chromatographie le l'acide lactique et autres acides organiques

butanol 1 = 1 volume additionné de bleu de bromophénol (jaune à pH<4,5), 1 g/litre de butanol

acide acétique glacial : 0,5 volume

eau distillée : 0,5 volume

Eau de chaux

Mise en évidence de dégagement de CO2 par précipitation de carbonate de calcium

Placer de l'hydroxyde de calcium Ca(OH)2 à saturation (plus de dissolution) dans un grand récipient contenant de l'eau déminéralisée.

Boucher, agiter. On obtient du lait de chaux.Laisser décanter au moins 24h puis filtrer.

Bien remplir les flacons et les boucher hermétiquement (attention à la contamination par le CO2 de l'air)

Eau iodée (lugol)

Colore l'amidon se colore en bleu et le glycogène en acajou

Colorations + ou - foncées en fonction de la concentration

Dissoudre 20g d'iodure de potassium dans un peu d'eau distillée puis ajouter 10g d'iode bisublimé.

Compléter à 1000 ml d'eau distillée (ajouter éventuellement un peu d'iode pour permettre la dissolution totale de l'iode).

Conserver dans une bouteille en verre brun. S'utilise dilué et se décolore à la longue.

Eau physiologique

 Multiples usages

9g de NaCl pour 1000ml d'eau distillée

Électrolyte pour sonde oxymétrique

Remplissage des têtes de sondes type ExAO Jeulin et autres

Na3PO4 à 30g/l soit 1,5g par flacon de 30ml

Empois d'amidon

Digestion des glucides, actions des enzymes.

Faire bouillir 80 ml d'eau distillée. Dissoudre 1 g de poudre d'amidon dans 10 ml d'eau distillée. Agiter (lait d'amidon).

Verser cette suspension dans l'eau bouillante puis agiter. Poursuivre l'ébullition 1 à 2 minutes.

La solution doit rester translucide et non blanche. Cette solution peut se conserver au réfrigérateur pendant plusieurs semaines.

 

Réactif de Hill

Réaction de Hill sur des chloroplastes isolés (ExAO)

3,29g de ferricyanure de potassium (K3[Fe(CN)6] dans 100ml d'eau distillée

Liquide de KNOP

Cultures hors sol ; in-vitro

Cultures d'algues

Eau distillée :1000g

Nitrate de Ca :1g

Nitrate de K :0,25g

Phosphate de K :0,25g

Sulfate de Mg (ou sulfate de Ca) :0,25g

Phosphate de fer 0,1g

Préparation d'une suspension de levures

Respiration - Fermentation cellulaire -ExAO - Observation microscopique (comptage ; bourgeonnement)

  • Milieu oxygénée, pour respiration : suspension à 5 g/l, à oxygéner au minimum 2 h avant le TP dans une éprouvette au fond de laquelle plonge un diffuseur d'aquarium aérant la suspension
  • Milieu non oxygénée pour fermentation : suspension à 15 g/l

Milieu d'extraction des mitochondries

Milieu permettant l'extraction de mitochondries (de cœur de bœuf par ex.) en vue d'une expérimentation ExAO sur la respiration mitochondriale.

solution A de phosphate monopotassique à 9,08g de KH2PO4 par litre,

solution B de phosphate disodique à 9,47g de Na2HPO4 par litre,

mélanger 322mL de la solution B et 78mL de la solution A pour obtenir 400mL de solution tampon à pH= 7,2

ajouter aux 400 mL, 800mg de Sérum Albumine bovine (S.A.B.),

ajouter enfin 45g de mannitol et éventuellement 0,02 g de KCl et 0,02g de MgCl2.

Liquide de Ringer

Liquide physiologique, usages multiples

6,5g de NaCl + 0,25g de KCl + 0,12g de CaCl2 + 0,20g de NaHCO3

Rouge de Crésol

Rouge à PH neutre, il vire au jaune pour un PH < à 7.4 et au pourpre pour pour un PH supérieur à 9.

Mélanger dans 1 L d'eau distillée (prendre de l'eau distillée du commerce ou bien la dégazer après distillation en la faisant bouillir)

0,084 g de bicarbonate de sodium ou hydrogénocarbonate de sodium;

7,46 g de chlorure de potassium;

0.01 g de poudre de rouge de Crésol.

Rouge Ponceau

Colorant des bandes de gel d'électrophorèse

Colorant des dépôts d'immunodiffusion

Diluer le rouge Ponceau à raison de 13 ml pour 90 ml d'eau distillée

Rouge neutre

De couleur rouge, il vire au jaune pour un PH > à 8

Colorant de la vacuole, s'utilise sur toutes les cellules végétales

Dissoudre 1 g de rouge neutre dans 1000 ml d'eau à PH 7 (eau de Volvic).

Le rouge neutre en solution ne se conserve pas longtemps et doit donc être préparé peu de temps à l'avance.

Rouge Soudan

Colore les inclusions lipidiques par transfert; s'utilise sur le lait, les coupes de graines à réserves lipidiques

Dissoudre 1 g de rouge soudan dans 100ml d'alcool à 70 %.

Laisser décanter puis filtrer.

Solution de succinate de sodium

Substrat pour l'étude des mitochondries

Faire 10 mL à une concentration de 400 mmoles (acide succinique C4H6O4, PM=118 g), amener ensuite, au pH-mètre, avec de la soude à 30%, l'acide succinique à pH=7,2. si l'on dispose de succinate de sodium, faire simplement une solution de succinate à 20 g/L (contrôler le pH et l'amener éventuellement à 7,2).

Solution zéro

Solution de calibrage des sondes oxymétriques

sulfite de sodium (Na2SO3) ou hyposulfite de sodium (Na2S2SO3) en solution saturée (attention de conserver le flacon bien fermé et plein pour éviter l'oxydation)

NB : ajouter au fond du flacon des billes de verre au fur et à mesure qu'il se vide

Tampon phosphate-saccharose

Milieu d'extraction des chloroplastes pour la réaction de Hill (ou de mitochondries végétales)

pour 1000 ml d'eau distillée :

171g de saccharose + 36,5g de Na2HPO4 + 16,6g de KH2PO4

Tampon phosphate salin : PBS

Lavage ou dilution des cellules ; Dilution du gel d'agar-agar (immunodiffusion)

Ce tampon simule les conditions physiologiques

pour 1000 ml d'eau distillée :

7,65g de NaCl, 0,724g de Na2PO4 et 0,210g de NaPO4

Tampon Tris-veronal

trempage des bandes cellogel à électrophorèse

remplissage des cuves à électrophorèse

Diluer le Tris Veronal à raison de 10ml pour 90 ml d'eau.

La solution se conserve un mois environ au réfrigérateur et se réutilise.

Vert d'iode

Colorant de la lignine, du suber et de la cutine

Dissoudre 1 g de vert d'iode dans 100 ml d'eau distillée.

Vert de méthyl acétique

Coloration des noyaux, des chromosomes et de l'ADN

1g de vert de méthyl en poudre

55ml d'eau distillée

45ml d'acide acétique